GBX eFAst-Lab水分活度儀在調(diào)控山梨醇向還原糖轉(zhuǎn)化及水分狀態(tài)分析中的應(yīng)用

2024年3月，來(lái)自江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的夏書芹研究團(tuán)隊(duì)，在期刊《Food Bioscience》（IF=5.9）上發(fā)表了一項(xiàng)研究。該研究探討了甘油對(duì)山梨醇-甘氨酸體系在熱處理過程中褐變反應(yīng)的影響機(jī)制，具體研究了甘油濃度與加熱時(shí)間對(duì)該體系褐變程度、無(wú)色中間產(chǎn)物積累、熒光物質(zhì)生成及α-二羰基化合物動(dòng)態(tài)變化的影響，并從水活度和水分狀態(tài)角度解釋了甘油依賴型褐變的原因。

摘要

在山梨醇和氨基酸體系的高溫加工和長(zhǎng)期儲(chǔ)存過程中，觀察到了意想不到的褐變現(xiàn)象。本研究探討了甘油對(duì)不同熱處理時(shí)間下山梨醇-甘氨酸模型體系褐變反應(yīng)的影響。結(jié)果證實(shí)，部分山梨醇會(huì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖，這些還原糖與甘氨酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成類黑精。甘油濃度和加熱時(shí)間與反應(yīng)進(jìn)程呈正相關(guān)，這反映在褐變指數(shù)增加、無(wú)色中間產(chǎn)物增加以及熒光物質(zhì)積累上。與不含甘油的體系相比，當(dāng)甘油濃度為4 mol/L時(shí)，褐變指數(shù)增加了約100倍，無(wú)色中間產(chǎn)物的積累增加了65倍。此外，體系中α-二羰基化合物（乙二醛、甲基乙二醛和2,3-丁二酮）的含量受到甘油的影響，隨著類黑精的積累呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在加熱2 h后達(dá)到190.6 mg/L的峰值。甘油依賴型褐變與體系始終處于較高水平的水活度（>0.80）以及游離水向固定水的遷移率（0.60%至8.59%）有關(guān)。這表明，甘油可通過影響底物濃度、削弱產(chǎn)物的抑制作用以及促進(jìn)山梨醇向還原糖的轉(zhuǎn)化來(lái)推動(dòng)褐變反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料

山梨醇、乙二醛和2,3-丁二酮、甲基乙二醛、甘油、甘氨酸、葡萄糖和果糖、鄰苯二胺

實(shí)驗(yàn)儀器

紫外-可見分光光度計(jì)、熒光光譜儀、高壓離子色譜儀、超高效液相色譜儀、GBX eFAst-Lab水分活度儀、脈沖核磁共振分析儀、壓力反應(yīng)瓶、油浴鍋

實(shí)驗(yàn)過程

1、反應(yīng)溶液的配制：用去離子水配制含有0.25 mol/L甘氨酸、1.25 mol/L山梨醇和不同濃度甘油（0-4.00 mol/L）的反應(yīng)溶液，使用HCl溶液（2.00 mol/L）和NaOH溶液（2.00 mol/L）將pH調(diào)節(jié)至6.80。將溶液轉(zhuǎn)移至壓力反應(yīng)瓶中，在120°C的油浴中分別加熱0、1、2、3和4 h。加熱結(jié)束后，將樣品取出并置于冰水中以終止反應(yīng)。

2、褐變指數(shù)與無(wú)色中間產(chǎn)物的測(cè)定：取反應(yīng)溶液，使用紫外-可見分光光度計(jì)在420 nm波長(zhǎng)下測(cè)定褐變指數(shù)，在294 nm波長(zhǎng)下測(cè)定無(wú)色中間產(chǎn)物含量。由于吸光度超出有效范圍，將溶液濃度稀釋至原濃度的1/10后在294 nm下進(jìn)行測(cè)定。

3、熒光強(qiáng)度測(cè)定：使用熒光光譜儀對(duì)反應(yīng)溶液中的熒光物質(zhì)強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為347 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍設(shè)為400-600 nm。

4、還原糖含量的測(cè)定：采用高壓離子色譜儀（HPIC）測(cè)定還原糖（葡萄糖、果糖）含量。使用PA20色譜柱進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相A為0.1 mol/L乙酸鈉溶液，流動(dòng)相B為250 mmol/L NaOH溶液。色譜條件為：0-13 min保持2% NaOH，13-14 min線性梯度從2% NaOH升至80% NaOH，14-23 min保持80% NaOH。流速10.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

5、α-二羰基化合物的測(cè)定：采用鄰苯二胺（OPD）對(duì)α-二羰基化合物（乙二醛GO、甲基乙二醛MGO和2,3-丁二酮）進(jìn)行衍生化處理，使其轉(zhuǎn)化為喹喔啉結(jié)構(gòu)。使用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（UPLC-TQD）進(jìn)行定量檢測(cè)。色譜條件：Agilent LiChrospher C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm, 5 μm），柱溫40°C，進(jìn)樣量1 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，流速1 mL/min。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序?yàn)椋?-1 min保持0%乙腈，1-10 min線性梯度升至30%乙腈，10-12 min線性梯度升至50%乙腈，12-12.5 min線性梯度升至100%乙腈，12.5-15 min線性梯度降至0%乙腈。質(zhì)譜采用電噴霧正離子模式（ESI+）檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：GO：y = 95.98x + 194.5（R2 = 0.9991），MGO：y = 745.18x – 2071.7（R2 = 0.9995），2,3-BD：y = 1952.4x – 4303.7（R2 = 0.9997）。

6、水活度的測(cè)定：使用GBX eFAst-Lab水分活度儀測(cè)定樣品水活度。測(cè)試前，選擇水活度為0.84的標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)水活度測(cè)定儀進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)完成后，將4 mL樣品溶液置于樣品盤中，在25°C下進(jìn)行測(cè)定。

GBX eFAst-Lab水分活度儀

7、水分狀態(tài)分析：使用脈沖核磁共振分析儀（LF-NMR）對(duì)水分狀態(tài)進(jìn)行分析。將裝有5 mL樣品的樣品瓶放入直徑25 mm的核磁管中，通過CPMG RF脈沖序列采集信號(hào)。參數(shù)設(shè)置為：90°脈沖時(shí)間7 μs，180°脈沖時(shí)間14 μs，重復(fù)時(shí)間9000 ms，回波次數(shù)16000次，回波時(shí)間1.3 ms。最后使用核磁共振反演軟件（版本2.0）獲得橫向弛豫時(shí)間（T2）曲線。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

1. 甘油促進(jìn)褐變反應(yīng)：隨著甘油濃度和加熱時(shí)間的增加，體系褐變指數(shù)和無(wú)色中間產(chǎn)物含量均呈上升趨勢(shì)。當(dāng)甘油濃度為4 mol/L時(shí)，與不含甘油的體系相比，褐變指數(shù)增加約100倍，無(wú)色中間產(chǎn)物積累增加65倍。這表明甘油能夠推動(dòng)山梨醇-甘氨酸體系的褐變反應(yīng)進(jìn)程。

2. 甘油影響α-二羰基化合物動(dòng)態(tài)變化：α-二羰基化合物（乙二醛、甲基乙二醛和2,3-丁二酮）在體系中的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在加熱2 h后達(dá)到190.6 mg/L的峰值。這表明隨著反應(yīng)進(jìn)入類黑精積累階段，α-二羰基化合物的消耗速率大于生成速率。

含不同濃度甘油的山梨醇-甘油醛體系在不同時(shí)間熱處理后水活度的變化

3. 甘油通過水分狀態(tài)調(diào)控反應(yīng)：體系水活度始終保持在較高水平（>0.80）。隨著甘油濃度升高，游離水比例降低（從加熱4 h后的99.43%降至91.41%），固定水比例增加。游離水減少有利于山梨醇的脫水分解，促進(jìn)還原糖的生成，從而推動(dòng)美拉德反應(yīng)。

4. 反應(yīng)機(jī)制：部分山梨醇轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖，暴露出羰基，與甘氨酸發(fā)生美拉德反應(yīng)生成類黑精。甘油通過影響底物濃度、削弱產(chǎn)物抑制作用以及促進(jìn)山梨醇向還原糖的轉(zhuǎn)化來(lái)增強(qiáng)褐變反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

1.Martins, S., & van Boekel, M. (2005). A kinetic model for the glucose/glycine Maillard reaction pathways. Food Chemistry, 90(1-2), 257-269. 

2.Smarrito-Menozzi, C., Matthey-Doret, W., Devaud-Gounoens, S., & Viton, F. (2013). Glycerol, an underestimated flavor precursor in the Maillard reaction. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61(43), 10225-10230. 

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