IITCMRBP鼠尾血壓監(jiān)測(cè)儀在參苓白術(shù)散對(duì)代謝綜合征鼠胰島素抵抗的影響中應(yīng)用

來自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院的蔡海榮團(tuán)隊(duì)在《廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》發(fā)表了題為“參苓白術(shù)散對(duì)代謝綜合征大鼠胰島素抵抗、炎癥狀態(tài)的影響"的研究論文。該研究以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用高脂高糖高鹽飼料喂養(yǎng)方法構(gòu)建代謝綜合征（Metabolic Syndrome，MS）大鼠模型，觀察參苓白術(shù)散對(duì)MS大鼠的治療效果，并探索其作用機(jī)制。

 摘要

【目的】探討參苓白術(shù)散對(duì)代謝綜合征（MS）大鼠的治療作用及機(jī)制。

【方法】將40只大鼠分為正常組（10只）和造模組（30只）。造模組大鼠采用高脂高糖高鹽飼料喂養(yǎng)方法構(gòu)建MS模型。將造模成功的21只MS大鼠隨機(jī)分為模型組（7只）、中藥組（7只）、西藥組（7只），正常組納入大鼠9只。中藥組給予參苓白術(shù)散水煎液灌胃，西藥組給予鹽酸二甲雙胍生理鹽水溶液灌胃，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，治療時(shí)間為4周。給藥結(jié)束后，檢測(cè)大鼠體質(zhì)量、腹圍、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、空腹血糖（FPG）、胰島素（FINS）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、脂肪酸（FFA），計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估的胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、肥胖指數(shù)、Lee‘s指數(shù)；酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測(cè)大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素8（IL-8）；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（QPCR）法檢測(cè)肝臟NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、Toll樣受體4（TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）mRNA表達(dá)；蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察肝臟病理變化。

【結(jié)果】與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、腹圍、肥胖指數(shù)、Lee’s指數(shù)、SBP、DBP、FPG、FINS、TC、TG、LDL-C、FFA、HOMA-IR、TNF-α、IL-1、IL-8水平均升高，HDL-C降低，肝臟NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)水平均升高，HE染色結(jié)果顯示肝臟脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；中藥組上述各指標(biāo)較模型組均得到改善（P < 0.05），且與西藥組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

【結(jié)論】參苓白術(shù)散可以改善MS大鼠糖脂代謝障礙、胰島素抵抗，減輕肝臟脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其機(jī)制可能與抑制炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-8釋放及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA的表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥狀態(tài)有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：

40只SPF級(jí)6周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量（180 ± 20）g

藥物：參苓白術(shù)散由黨參12 g、白術(shù)12 g、茯苓12 g、炙甘草12 g、山藥12 g、炒扁豆9 g、薏苡仁6 g、砂仁6 g、蓮子肉6 g、桔梗6 g、陳皮6 g組成。鹽酸二甲雙胍片

飼料：基礎(chǔ)飼料和高脂高糖高鹽飼料

主要試劑：

大鼠胰島素（FINS）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、總膽固醇（TC）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒、大鼠游離脂肪酸（FFA）ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素1（IL-1）ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素8（IL-8）ELISA試劑盒、TRIzol總RNA提取試劑盒、HiScript II U+ One Step qRT-PCR、cDNA一鏈合成試劑盒

主要儀器

Applied Biosystems PCR儀、StepOnePlus™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)、UV-5100紫外可見分光光度計(jì)、C5080R高速冷凍離心機(jī)、BSA224S電子天平、IITC MRBP鼠尾血壓監(jiān)測(cè)儀

IITC MRBP鼠尾血壓監(jiān)測(cè)儀

實(shí)驗(yàn)方法與過程

動(dòng)物模型構(gòu)建

40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常組（10只）和造模組（30只），所有大鼠分籠單獨(dú)喂養(yǎng)。正常組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠給予高脂高糖高鹽飼料喂養(yǎng)。所有大鼠自由飲水，造模時(shí)間12周。

造模成功判定標(biāo)準(zhǔn)

12周后根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判定造模是否成功：①體質(zhì)量、②空腹血糖（FPG）、③收縮壓（SBP）或舒張壓（DBP）、④TG高于正常組大鼠平均值+1.4倍標(biāo)準(zhǔn)差，⑤HDL-C低于正常組大鼠平均值-1.4倍標(biāo)準(zhǔn)差，滿足①的基礎(chǔ)上滿足②③④⑤中任意2項(xiàng)即可判斷MS造模成功。第12周末，造模組死亡1只、8只造模不成功予以剔除，正常組1只胰島素水平過高予以剔除。

分組與給藥

造模成功的21只MS大鼠隨機(jī)分為模型組（7只）、中藥組（7只）、西藥組（7只），正常組9只作為正常組。根據(jù)大鼠與人藥物劑量換算方法，中藥組大鼠給予參苓白術(shù)散水煎液（生藥劑量10 g·kg?1·d?1）灌胃，西藥組大鼠給予鹽酸二甲雙胍生理鹽水溶液（劑量105 mg·kg?1·d?1）灌胃，正常組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥4周。

標(biāo)本采集

末次給藥后禁食不禁水12 h，腹腔注射麻醉后，經(jīng)腹中線開腹后腹主動(dòng)脈采血10 mL，3000 r/min離心（離心半徑為16 cm），取上清液，-80℃保存待測(cè)。取大鼠雙腎周脂肪組織，稱質(zhì)量并記錄。取大鼠肝臟組織，-80℃保存待測(cè)。

一般狀態(tài)觀察與指標(biāo)檢測(cè)

記錄大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)、尿量、毛發(fā)等。電子天平測(cè)量大鼠體質(zhì)量；軟尺測(cè)量大鼠腹圍和體長(zhǎng)；無創(chuàng)血壓儀測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈血壓；計(jì)算Lee‘s指數(shù) = 體質(zhì)量（g）× 1000 / 體長(zhǎng)（cm）；肥胖指數(shù) = 腎周脂肪質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）× 100%。血糖儀檢測(cè)FPG；ELISA法檢測(cè)大鼠血清FINS、FFA、TNF-α、IL-1、IL-8含量；生化分析儀檢測(cè)大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

QPCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)

取肝臟組織，TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物由廣州泰盛生物科技有限公司合成。采用2?ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算各目的基因表達(dá)量。

HE染色觀察肝組織病理變化

將肝組織石蠟切片脫蠟至水。將切片入蘇木素染3 ~ 8 min，自來水洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗，入伊紅染液中染色1 ~ 3 min。脫水封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一般狀態(tài)比較

正常組大鼠毛發(fā)濃密、色澤光亮，活潑好動(dòng)，精神飽滿，反應(yīng)靈敏，進(jìn)食正常，排便無異味；模型組大鼠毛發(fā)稀疏，色澤晦暗，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，倦怠懶動(dòng)，進(jìn)食增加，排便明顯異味；中藥組和西藥組大鼠毛發(fā)、精神、反應(yīng)、進(jìn)食和排便均較模型組好轉(zhuǎn)。

肥胖指標(biāo)和血壓比較

與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、腹圍、肥胖指數(shù)、Lee’s指數(shù)、SBP、DBP均升高（P < 0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠上述各項(xiàng)指標(biāo)均降低（P < 0.05）；中藥組與西藥組比較，上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

糖代謝指標(biāo)比較

與正常組比較，模型組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR均升高（P < 0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR均降低（P < 0.05）；中藥組與西藥組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

脂代謝指標(biāo)比較

與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA水平均升高（P < 0.05），HDL-C水平降低（P < 0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA水平均降低（P < 0.05），HDL-C水平升高（P < 0.05）；中藥組與西藥組比較，血清TC、TG、LDL-C、FFA水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

血清炎癥指標(biāo)比較

與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-8含量均升高（P < 0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-8含量均降低（P < 0.05）；中藥組與西藥組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

肝臟NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)比較

與正常組比較，模型組大鼠肝臟NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)水平均升高（P < 0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠上述mRNA表達(dá)水平均降低（P < 0.05）；中藥組與西藥組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

肝臟組織病理變化比較

正常組大鼠肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列緊密；模型組大鼠肝細(xì)胞廣泛脂肪變性，細(xì)胞腫脹，充滿脂質(zhì)空泡，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；中藥組和西藥組脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均減輕。中藥組和西藥組脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度無明顯差異。

結(jié)論與討論

代謝綜合征（MS）由高血壓、高血糖、血脂異常和腹型肥胖組成。胰島素抵抗是MS的中心環(huán)節(jié)，且與炎癥密切相關(guān)。中醫(yī)理論中，MS屬于“痰濁"“肥胖"范疇，主要病機(jī)為脾虛痰濁。參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》，具有健脾化濕功效。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠體質(zhì)量、腹圍、SBP、DBP、FPG、FINS、TC、TG、LDL-C均升高，HDL-C降低，HOMA-IR升高，提示MS大鼠模型構(gòu)建成功，并伴高胰島素血癥。中藥組大鼠體質(zhì)量、腹圍、肥胖指數(shù)、Lee’s指數(shù)、FPG、FINS、HOMA-IR、SBP、DBP、TC、TG、LDL-C均降低，HDL-C升高；HE染色結(jié)果提示肝臟脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。參苓白術(shù)散可以減輕MS大鼠體質(zhì)量、改善糖脂代謝和胰島素抵抗，減輕肝臟脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，中藥組大鼠血清FFA濃度較模型組降低。FFA是脂肪代謝的中間產(chǎn)物，可以造成胰島素靶器官對(duì)胰島素敏感性降低，引起高胰島素血癥。參苓白術(shù)散可能通過減輕FFA含量來改善胰島素抵抗。

MS是一種低度的系統(tǒng)性炎癥狀態(tài)，往往伴隨著炎癥因子水平升高。NLRP3、TLR4、NF-κB通路介導(dǎo)TNF-α、IL-1、IL-8等炎性因子的生成，炎癥因子干擾IRS/PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致胰島素抵抗。本研究結(jié)果顯示，中藥組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-8和肝臟組織NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)較模型組降低，提示參苓白術(shù)散通過抑制NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA的表達(dá)減輕MS大鼠炎癥狀態(tài)。

綜上，參苓白術(shù)散可以改善MS大鼠糖脂代謝障礙、胰島素抵抗，減輕肝臟脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其機(jī)制可能與抑制炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-8釋放及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥狀態(tài)有關(guān)。

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